Vedoucí v technologii jednotlivých molekul
Navzdory omezení citlivosti, rychlosti a velikosti sekvencí, které byly získány, byla nová metoda sekvence popsaná v PNAS nová a ukázala dostatečný slib, že by upoutala pozornost rizikových kapitalistů, kteří se obrátili na profesora ohledně investování do své technologie. Muselo se jednat o techniku, kterou investoři chtějí investovat, neboť to bylo první , podle dlouhodobého zaměstnance a vedoucího výzkumu Dr. Timothyho Harrise ... rizikové investory obvykle nechodí vědci, je to naopak !
Publikace PNAS byla vydána 1. dubna 2003, první kolo financování nové společnosti bylo zahájeno 19. prosince 2003 a dne 2. ledna 2004 společnost Helicos otevřela své dveře se 5 zaměstnanci, včetně Dr. Harris, odborník na měření vědy a technologii jednotlivých molekul. Společnost Helicos se v současné době nachází v Cambridge MA, USA a po dvou kolech investičního financování a od založení společnosti na burze dne 27. května 2007 je nyní veřejně obchodována pod NASDAQ: HLCS .
Helicos se specializuje na technologie genetické analýzy, zejména technologii True Single-Molecule Sequencing (tSMS TM ) , potvrzené sekvenováním genomu M13 viru, jak bylo popsáno v časopise Science Magazine v dubnu 2008. Specializovaná platforma tSMS TM používá HeliScope TM Single Sequencer molekul .
Podle Dr. Harrisa tento konkrétní projekt byl zahájen v lednu 2004 a do června 2005 úspěšně sekvenoval virus M13, lékařsky významnou sekvenci popsanou v časopise Science.
Jak funguje tSMS TM ?
Pásmo DNA přibližně 100-200 párů bází se rozřezá na menší fragmenty s použitím restrikčních enzymů a přidávají se polyA ocasy. Zkrácené prameny se potom hybridizují s deskou průtoku Helicos, která má na svém povrchu vázané miliardy polyT řetězců. Každá hybridizovaná šablona je sekvenována najednou. Proto lze číst miliardy za běh. Označování se provádí v "čtveřicích" sestávajících z 4 cyklů pro každou ze 4 nukleotidových bází. Dále jsou přidány zářivky označené zářivkami a laser v přístroji osvětluje štítek, přičemž čtete, které prameny přijaly tuto značenou základnu. Nálepka je potom rozštěpena a další cyklus začíná novou základnou. Poté, co byla průtoková buňka ošetřena s každou bází (4 cykly), quad je kompletní a nová začíná opět s počáteční nukleotidovou bází.
V současné době může HeliScope TM číst fragmenty DNA o délce přibližně 55 párů bází. Čím více základu v sekvenci, tím nižší je procento pramenů, které lze použít ve vzorku, protože některé prameny se během procesu přestávají prodloužit.
Pro čtení asi 20 základů lze použít asi 86% pramenů. Pro delší čtení (55 + základních párů) klesá tento procentní podíl na přibližně 50%.
Výhoda jedné molekuly
Zatímco několik dalších společností nabízí různé sekvencování podle syntetických technologií s vysokorychlostními platformami, různými reagenty, za srovnatelné náklady a pro krátké čtení 25-40 párů bází, pouze Helicos čte sekvenci DNA jeden nukleotid najednou s jejich patentovaným která je dostatečně citlivá, aby umožnila čtení na jediné molekule. Jiné metody vyžadují, aby byla DNA amplifikována (pomocí PCR ), aby se před sekvenováním vytvořily více (miliony) kopií. Zavádí potenciál významného stupně nepřesnosti kvůli chybám zpracování polymerázovými enzymy během amplifikace.
Od dubna 2008 byl HeliScopeTM údajně schopen sekvenovat miliardy nukleotidových bází denně.
Helicos je členem Personalizované lékařské koalice a získal grantové financování "genomu 1000 $" . $ 1000 genom za jeden den je plánovaným cílem, který by vyžadoval, aby sekvencer zpracoval miliardy základů za hodinu. V současné době prototypový sekvencer trvá roky, než identifikuje celý genom, který by stálo mnohem více než 1000 dolarů.
Aplikace pro technologii tSMSTM jsou mnoho, včetně detekce genetických variant u lidí a jiných druhů pro stanovení příčin choroby, odolnost vůči antibiotikům u bakterií, virilitu virem a další. Schopnost detekovat jediný gen bez amplifikace má mnoho potenciálních použití v environmentální mikrobiologii, neboť genetické techniky se často používají k detekci životaschopných, nekultivovatelných mikroorganismů nebo těch, které se nacházejí v půdě a jiných matricích, které zakazují izolaci současnými metodami. Navíc povaha vzorků životního prostředí často způsobuje potíže při amplifikaci genů pomocí PCR, kvůli problémům s kontaminací. Nicméně tyto obtíže by také musely být překonány, aby polymerázové enzymy používané v tSMSTM fungovaly bez interferencí.
Teorie sekvencování jednotlivých molekul je poměrně základní a možná se divíte, proč o tom nikdo nepomyslel dříve. Ačkoli to zní jednoduše, existuje mnoho technických komponent, které se podílejí na vývoji těchto platforem a spousta výzev, aby se Helicos zaneprázdnil, včetně vývoje nových chemických reakcí a činidel, talířů a vysoce výkonných čteček. Schopnost detekovat fluorescenci jediného štítku na jediné bázi vyžaduje vysoce citlivé vybavení a chemie pro značení a detekci signálů musí být správná, aby minimalizovala interferenci a optimalizovala věrnost DNA polymerázy, jak se aplikuje na imobilizované šablony a označené nukleotidy. To jsou některé výzvy, kterým Helicos čelí, protože pokračuje v rozvoji této technologie v naději, že jednoho dne přinese lidský genom v hodnotě 1000 dolarů.