Sekvenování DNA je také závislé na naší schopnosti používat gelovou elektroforézu k separaci řetězců DNA, která se liší velikostí jen o pár párů bází.
Sekvenování DNA
V pozdních sedmdesátých letech byly vynalezeny dvě DNA sekvenační techniky pro delší DNA molekuly. Jednalo se o metodu Sanger (nebo dideoxy) a metodu Maxam-Gilberta (chemické štěpení). Metoda Maxam-Gilbert je založená na nukleotidově specifickém štěpení chemickými látkami a je nejlépe použita pro sekvenci oligonukleotidů (krátké nukleotidové polymery, obvykle menší než 50 párů párů bází). Metoda Sanger je běžněji používána, protože byla prokázána technicky snadnější aplikace a při příchodu PCR a automatizace techniky se snadno aplikuje na dlouhé řetězce DNA včetně některých celých genů. Tato technika je založena na ukončení řetězce pomocí dideoxynukleotidů během PCR prodlužovacích reakcí.
Metoda Sanger
V metodě Sanger se použije analyzovaný řetězec DNA jako templát a DNA polymeráza se použije v PCR reakci k vytvoření komplementárních řetězců za použití primerů.
Vyrobí se čtyři různé PCR reakční směsi, z nichž každá obsahuje určité procento analogů dideoxynukleosid trifosfátu (ddNTP) k jednomu ze čtyř nukleotidů (ATP, CTP, GTP nebo TTP). Syntéza nového vlákna DNA pokračuje, dokud není začleněn jeden z těchto analogů, přičemž v tomto okamžiku je vlákno předčasně zkráceno.
Každá PCR reakce bude mít konec obsahující směs různých délek řetězců DNA, všechny končící nukleotidem, který byl pro tuto reakci značen dideoxy. Gelová elektroforéza se pak použije k oddělení pramenů čtyř reakcí ve čtyřech samostatných pruzích a určení sekvence původní šablony na základě toho, jaké délky pramenů končí s jakým nukleotidem.
V automatizované reakci Sanger se používají primery, které jsou označeny čtyřmi různými barevnými fluorescenčními značkami. PCR reakce, v přítomnosti různých dideoxynukleotidů, se provádějí způsobem popsaným výše. Následující čtyři reakční směsi se pak kombinují a aplikují do jediného pruhu gelu. Barva každého fragmentu je detekována pomocí laserového paprsku a informace jsou shromažďovány počítačem, který generuje chromatogramy znázorňující vrcholy pro každou barvu, ze kterých lze určit templátovou DNA sekvenci.
Typicky je metoda automatického sekvenování pouze přesná pro sekvence až do maximální délky přibližně 700-800 párů bází. Je však možné získat úplné sekvence větších genů a ve skutečnosti celé genomy pomocí postupných metod, jako je například sekvenování primerů Walker a Shotgun.
V Primer Walkingu je funkční část většího genu sekvenována metodou Sanger. Nové primery se generují ze spolehlivého segmentu sekvence a používají se k pokračování sekvence části genu, která byla mimo rozsah původních reakcí.
Sledování sekvencí dělají náhodně řezání segmentu DNA, který je předmětem zájmu, do vhodnějších (spravovatelných) velikostí fragmentů, sekvenování každého fragmentu a uspořádání kusů na základě překrývajících se sekvencí. Tato technika byla usnadněna použitím počítačového softwaru pro uspořádání překrývajících se kusů.