Jaká PCR má dělat sekvenční DNA a zesilující geny
Polymerázová řetězová reakce ( PCR ) je molekulární genetickou technikou pro tvorbu více kopií genu a je také součástí procesu genového sekvenování.
Jak funguje polymerázová řetězová reakce?
Genetické kopie jsou vytvářeny pomocí vzorku DNA a technologie je dostatečně dobrá, aby vytvořila více kopií z jedné kopie genu nalezeného ve vzorku. PCR amplifikace genu pro vytvoření milionů kopií umožňuje detekci a identifikaci genových sekvencí pomocí vizuálních technik založených na velikosti a náboji (+ nebo -) části DNA.
Za kontrolovaných podmínek vytvářejí malé segmenty DNA enzymy známé jako DNA polymerázy, které přidávají doplňkové deoxynukleotidy (dNTP) k části DNA známou jako "šablona". Dokonce i menší části DNA, nazvané "primery", se používají jako výchozí bod pro polymerázu. Primery jsou malé umělé kusy DNA (oligomery), obvykle mezi 15 a 30 nukleotidy. Jsou vyrobeny znalostí nebo hádkou o krátkých sekvencích DNA na samotných koncích amplifikovaného genu. Během PCR se DNA sekvence zahřeje a dvojité vlákna se oddělí. Po ochlazení se primery vážou na šablonu (nazývané žíhání) a vytvoří místo pro začátek polymerázy.
Technika PCR
Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla umožněna objevením termofilů a termofilních polymerázových enzymů (enzymy, které udržují strukturální integritu a funkčnost po zahřátí při vysokých teplotách).
Kroky zahrnuté v metodě PCR jsou následující:
- Vytvoří se směs s optimalizovanými koncentracemi DNA templátu, polymerázového enzymu, primerů a dNTP. Schopnost ohřívat směs bez denaturace enzymu umožňuje denaturaci dvojité šroubovice vzorku DNA při teplotách v rozsahu 94 stupňů Celsia.
- Po denaturaci se vzorek ochladí na mírnější rozmezí kolem 54 stupňů, což usnadňuje žíhání (navázání) primerů na šablony s jednovláknovou DNA.
- Ve třetím kroku cyklu se vzorek znovu ohřeje na 72 stupňů, což je ideální teplota pro Taq DNA polymerázu pro prodloužení. Během prodloužení používá DNA polymeráza původní šňůru DNA jako templátu pro přidání komplementárních dNTP na 3 'konce každého primeru a generuje sekci dvojvláknové DNA v oblasti požadovaného genu.
- Primery, které mají žíhané DNA sekvence, které nejsou přesně shodné, nezůstávají žíhány při 72 °, čímž se omezí prodloužení na požadovaný gen.
Tento proces denaturace, žíhání a prodloužení se opakuje několikanásobně (30-40) krát, čímž se exponenciálně zvyšuje počet kopií požadovaného genu ve směsi. Přestože by tento proces byl poměrně nudný, kdyby byl prováděn ručně, vzorky mohou být připraveny a inkubovány v programovatelném Thermocycleru, který je dnes ve většině molekulárních laboratoří obvyklý, a kompletní reakce PCR může být provedena za 3-4 hodiny.
Každý denaturační krok zastavuje prodlužovací proces v předchozím cyklu, čímž zkracuje nový řetězec DNA a udržuje ji přibližně na velikosti požadovaného genu.
Doba trvání prodlouženého cyklu může být delší nebo kratší v závislosti na velikosti požadovaného genu, ale nakonec, opakovanými cykly PCR, většina templátů bude omezena pouze na velikost dotčeného genu, neboť budou vyrobeny z produktů obou primerů.
Existuje několik různých faktorů úspěšné PCR, které lze manipulovat s cílem zlepšit výsledky. Nejčastěji používanou metodou pro testování přítomnosti produktu PCR je elektroforéza na agarózovém gelu . Který se používá k oddělení fragmentů DNA na základě velikosti a náboje. Fragmenty se pak vizualizují pomocí barviv nebo radioizotopů.
Evoluce
Od objevu PCR byly objeveny DNA polymerázy jiné než původní Taq. Některé z nich mají lepší "korekturní" schopnost nebo jsou stabilnější při vyšších teplotách, čímž se zlepšuje specificita PCR a snižují se chyby z vložení nesprávného dNTP.
Některé varianty PCR byly navrženy pro specifické aplikace a nyní se pravidelně používají v molekulárně genetických laboratořích. Některé z nich jsou PCR v reálném čase a reverzní transkriptáza PCR. Objev PCR také vedl k vývoji DNA sekvenování, DNA otisků prstů a dalších molekulárních technik.