Úpravy libovolné složky reakce polymerázové řetězové reakce (PCR) mohou měnit kvalitu výsledku buď zlepšením nebo snížením výtěžku a kvality produktu nebo zlepšením reakční specifičnosti a citlivosti. Parametry, které ovlivňují konečný výsledek, mohou být buď fyzikální (tj. Teplota, časy cyklu) nebo chemické (tj. Koncentrace templátů, typ použitého enzymu). Následuje několik klíčových faktorů, které ovlivňují úspěch PCR.
01 Čisté laboratorní podmínky
Vzhledem k tomu, že PCR je schopna detekovat jedinou molekulu DNA, je důležité udržovat nedotčené podmínky v laboratoři. Vždy používejte čerstvé rukavice, používejte sterilní skleněné nádoby, trubičky a hroty pipety a sterilní roztoky a před zahájením práce vyčistěte pracovní plochu.
Vždy uvádějte kontrolní reakce bez templátové DNA a bez enzymu, abyste zajistili, že výsledky jsou skutečně kvůli zesílení správného vzorku.
Většina lidí si ujistěte, že mají vlastní sadu řešení, která nejsou sdílena, aby usnadnily odstraňování problémů a označené pipety jsou často vyčleněny pouze pro PCR. Bezúdržbové PCR trubky s DNázou a RNázou, špičky pipet odolné proti aerosolu a práce v digestoři s UV světlem jsou také způsoby, jak minimalizovat problémy.
02 Chemické složky
- Máte 18 až 24 základů
- Nemají žádnou sekundární strukturu (tj. Vlásenkové smyčky)
- Vyvážené rozložení párů G / C a A / T
- Nejsou navzájem se navzájem komplementární na konci 3 stop
- Teploty tavení (Tm) mají teplotu kolem 5 až 10 stupňů Celcius pod teplotou žíhání, která je obvykle mezi 55 a 65 stupni Celcius
Hodnota Tm pro oba primery by měla být podobná pro nejlepší výsledky.
03 Reakční směs: Šablona a základy
Optimální koncentrace primeru jsou mezi 0,1 a 0,6 mikromolů / l. Množství šablony se mění v závislosti na typu DNA (lidský, bakteriální, plazmid).
Při velmi malém množství šablony existují další strategie ke zlepšení výsledků, jako je zvýšení počtu cyklů nebo použití "horkého startu". Vždy vyzkoušejte nové primery s pozitivní kontrolní reakcí, abyste se ujistili, že pracují za specifických experimentálních podmínek.
04 Reakční směs: aktivita enzymu
Koncentrace MgCl2 v reakční směsi může ovlivnit výsledek PCR a mohla by hrát důležitou roli při více náročných reakcích. Kation hořčíku tvoří rozpustné komplexy s dNTP za účelem vytvoření skutečného substrátu, který enzym polymerázy rozpoznává.
Stejná množství všech čtyř dNTP také pomáhají snížit míru chyb polymerázy. Některé přísady, jako je betain, BSA, detergenty, DMSO, glycerol a pyrofosfatáza, mohou také ovlivnit enzymovou specificitu nebo reakční účinnost.
05 Typ termocyklu
Při nákupu laboratorního vybavení mějte na paměti, že některé termocykléry jsou méně přesné než jiné při udržování přesných požadovaných teplot.
Jedná se o jednu oblast, v níž se levné peníze dlouhodobě nezaplatí, když se setkáte s jemnou reakcí nebo použitím primerů, které vyžadují úzký rozsah teploty žíhání.
Tenkostěnné reakční trubky navržené tak, aby odpovídaly přesné značce termocykloru, kterou používáte, také pomáhají optimalizovat reakční teploty.
06 Nastavení cyklu
Zvýšený výtěžek lze dosáhnout zvýšením prodloužení o každých 20 cyklů, aby se kompenzovalo méně enzymu, aby se zvětšila šablona. Obvykle méně než 40 cyklů stačí k amplifikaci méně než 10 templátových molekul k koncentraci dostatečně velké k zobrazení na agarózovém gelu obarveném ethidiumbromidem.