Klonování genů je děláním kopií nebo klonů jednoho genu. Jakmile je gen identifikován, klony mohou být použity v mnoha oblastech biomedicínského a průmyslového výzkumu. Genetické inženýrství je proces klonování genů do nových organismů nebo změna sekvence DNA pro změnu bílkovinného produktu. Genetické inženýrství závisí na naší schopnosti provádět následující základní postupy.
01 Reakce polymerázového řetězce
02 Enzymy restrikce
Objev enzymů známých jako restrikční endonukleázy byl nezbytný pro proteinové inženýrství . Tyto enzymy štěpí DNA na specifických místech na základě nukleotidové sekvence. Stovky různých restrikčních enzymů , schopných snížit DNA na odlišném místě, byly izolovány z mnoha různých kmenů bakterií. DNA štěpená restrikčním enzymem produkuje mnoho menších fragmentů různých velikostí. Ty mohou být odděleny pomocí gelové elektroforézy nebo chromatografie.
03 Elektroforéza
Čištění DNA z buněčné kultury nebo její řezání pomocí restrikčních enzymů by nebylo hodně užitečné, kdybychom nemohli vizualizovat DNA - tedy našli způsob, jak zkontrolovat, zda váš výpis obsahuje něco, nebo jakou velikost máte "To jste si vybrali. Jeden způsob, jak to udělat, je gelová elektroforéza. Gely se používají k různým účelům, od sledování řezané DNA k detekci DNA vložky a knockouts.
04 Připojte dva kusy DNA
V genetickém výzkumu je často nutné spojovat dva nebo více jednotlivých řetězců DNA, vytvořit rekombinantní vlákno nebo uzavřít kruhový pramen, který byl rozštěpen restrikčními enzymy. Enzymy nazvané DNA ligázy mohou vytvářet kovalentní vazby mezi nukleotidovými řetězci. Enzymy DNA polymerasy I a polynukleotid kináza jsou také důležité pro tento proces, pro vyplnění mezer nebo pro fosforylování 5 'konců.
05 Výběr malých samoregulujících DNA
Malé kruhovité části DNA, které nejsou součástí bakteriálního genomu, ale jsou schopné samoreprodukce, jsou známé jako plazmidy. Plazmidy se často používají jako vektory pro přenos genů mezi mikroorganismy. V biotechnologii, jakmile je zájmový gen zesílen a gen a plasmid jsou odštěpeny restrikčními enzymy, jsou ligovány dohromady a vytvářejí takzvanou rekombinantní DNA. DNA virové (bakteriofága) může být také použita jako vektor, stejně jako kosmidy, rekombinantní plazmidy obsahující bakteriofágové geny.
06 Metoda přesunutí vektoru do hostitelské buňky
Proces přenosu genetického materiálu na vektor, jako je plazmid, do nových hostitelských buněk se nazývá transformace. Tato technika vyžaduje, aby hostitelské buňky byly vystaveny změně prostředí, která je činí "kompetentní" nebo dočasně propustnou pro vektor. Electroporation je jedna taková technika. Čím je plazmid větší, tím nižší je účinnost, kterou je jeho buňka absorbována. Větší segmenty DNA se klonují snadněji pomocí bakteriofága, retroviru nebo jiných virových vektorů nebo kosmidů ve způsobu nazývaném transdukce. Fágové nebo virové vektory se často používají v regenerační medicíně, ale mohou způsobit vkládání DNA do částí našich chromozomů, kde ji nechceme, což způsobuje komplikace a dokonce i rakovinu.
07 Metody výběru transgenních organismů
Ne všechny buňky zabírají DNA během transformace. Je nezbytné, aby existoval způsob, jak zjistit ty, které to dělají. Obecně plazmidy nesou geny pro antibiotickou rezistenci a transgenní buňky mohou být vybrány na základě exprese těchto genů a jejich schopnosti růst na médiích obsahujících toto antibiotikum. Alternativní metody výběru závisejí na přítomnosti jiných reporterových proteinů, jako je systém x-gal / lacZ nebo zelený fluorescenční protein, které umožňují výběr založený na barvě a fluorescenci.