Vyvinutý v roce 1983 umožnil proces PCR provést sekvenování DNA a identifikovat pořadí nukleotidů v jednotlivých genech.
Metoda využívá tepelné cyklizace nebo opakované zahřívání a chlazení reakce pro tavení a replikaci DNA. Jak pokračuje PCR, "nová" DNA se používá jako templát pro replikaci a následná řetězová reakce exponenciálně amplifikuje templát DNA.
PCR techniky se používají v mnoha oblastech biotechnologie, včetně proteinového inženýrství , klonování, forenzní analýzy (DNA fingerprinting), testování otcovství, diagnostiky dědičných a / nebo infekčních onemocnění a pro analýzu vzorků životního prostředí.
Ve forenzii je obzvláště užitečná PCR, protože zesiluje dokonce i nejmenší množství důkazů DNA. PCR může být také použita k analýze DNA, která je tisíce let stará, a tyto techniky byly použity k identifikaci všechno od 800,000-rok-starý mamut k mumie z celého světa.
Postup PCR je následující:
- Inicializace: Tento krok je nezbytný pouze pro DNA polymerázy, které vyžadují PCR za tepla. Reakce se zahřeje na teplotu 94 až 96 ° C a udržuje se po dobu 1 až 9 minut.
- Denaturace: Pokud postup nevyžaduje inicializaci, denaturace je prvním krokem. Reakční směs se zahřívá na 94 až 98 ° C po dobu 20 až 30 sekund. Vodíkové vazby DNA templátu jsou narušeny a jednovláknové molekuly DNA jsou vytvořeny.
- Žíhání: Reakční teplota je nižší než 50 až 65 ° C a udržuje se 20 až 40 sekund. Primery přitahují k monovláknové DNA template. Teplota je během tohoto kroku nesmírně důležitá. Je-li příliš horký, primer nemusí být vázán. Je-li příliš chladno, může se základ neuspořádat. Vytvoří se dobrá vazba, když sekvence primeru přesně odpovídá sekvenci šablon.
- Prodloužení / prodloužení: Teplota během tohoto kroku se mění v závislosti na typu polymerázy. DNA polymeráza syntetizuje zcela nový řetězec DNA.
- Konečné prodloužení: Tento krok se provádí při teplotě 70 až 74 ° C po dobu 5 až 15 minut po konečném cyklu PCR.
- Konečný zásah: Tento krok je nepovinný. Teplota se udržuje na 4 až 15 ° C a reakce se zastaví.
Postup je rozdělen do tří fází:
- Exponenciální zesílení: Během každého cyklu se produkt (specifická část DNA, která se replikuje) zdvojnásobí.
- Vyrovnávací fáze: Jak DNA polymeráza ztrácí aktivitu a spotřebovává činidla, reakce se zpomaluje.
- Plošina: Nehromadí se žádný další produkt.