Požadovaný stupeň čistoty bílkovin závisí na předpokládaném konečném použití bílkovin.
Pro některé aplikace je dostatečný surový extrakt. Pro jiné použití, například v potravinách a léčivých přípravcích, je však nutná vysoká čistota. Pro dosažení tohoto cíle se obvykle používají několik způsobů čištění proteinů v sérii purifikačních kroků.
Každá fáze purifikace proteinu obvykle vede k určitému stupni ztráty produktu. Proto ideální strategie pro čištění proteinů je strategie, při níž se dosáhne nejvyšší úrovně čištění v nejmenších krocích. Výběr kroků k použití závisí na velikosti, náboji, rozpustnosti a dalších vlastnostech cílového proteinu. Následující techniky jsou nejvhodnější pro čištění jediného cytosolového proteinu. Purifikace cytosolových proteinových komplexů je komplikovanější a obvykle vyžaduje použití různých metod.
První kroky pro čištění proteinů
Prvním krokem při čištění intracelulárních (uvnitř buněk) proteinů je příprava surového extraktu .
Extrakt bude obsahovat komplexní směs všech proteinů z buněčné cytoplazmy a některých dalších makromolekul, kofaktorů a živin. Surový extrakt může být použit pro některé aplikace v biotechnologiích, avšak pokud je čistota problémem, musí být dodrženy následující kroky čištění.
Výtažky surových bílkovin se připravují odstraněním buněčné trosky generované buněčnou lýzou, která se dosahuje použitím chemikálií a enzymů , sonikací nebo francouzským lisem. Odpad se odstraní centrifugací a supernatant se izoluje. Surové přípravky extracelulárních proteinů mohou být získány jednoduchým odstraněním buněk centrifugací.
Pro určité biotechnologické aplikace existuje poptávka po termostabilních enzymech : enzymy, které mohou tolerovat vysoké teploty bez denaturace a při zachování vysoké specifické aktivity. Organismy, které je produkují, se někdy nazývají extremofily. Jednoduchým přístupem k čištění tepelně odolného proteinu je denaturace ostatních proteinů ve směsi zahřátím a následným ochlazením roztoku (čímž se termostabilní enzym nechá v případě potřeby reformovat nebo znovu rozpustit). Denaturované proteiny se potom mohou odstředit.
Střední kroky čištění
V minulosti byl běžným druhým krokem k čištění bílkoviny ze surového extraktu srážením v roztoku s vysokou osmotickou pevností (tj. Solnými roztoky). Nukleové kyseliny v surovém extraktu mohou být odstraněny srážením agregátů vytvořených se streptomycin sulfátem nebo protamin sulfátem.
Srážení bílkovin se obvykle provádí za použití síranu amonného jako soli.
Různé proteiny se vysráží v různých koncentracích síranu amonného . Obecně platí, že bílkoviny s vyšší molekulovou hmotností vysráží v nižších koncentracích síranu amonného. Srážení soli obvykle nevede k vysoce purifikovanému proteinu, ale může napomoci eliminaci některých nežádoucích proteinů ve směsi a koncentraci vzorku. Soli v roztoku se pak odstraní dialýzou přes porézní celulózovou hadičku, filtraci nebo gelovou vylučovací chromatografii.
Moderní biotechnologické protokoly často využívají mnoho komerčně dostupných sestav, které poskytují hotová řešení pro standardní postupy. Čištění proteinů se často provádí pomocí filtrů a připravených gelových filtračních kolon. Jediné, co musíte udělat, je postupovat podle pokynů a přidat správnou hlasitost správného roztoku a počkat na určitou dobu a sbírat eluční činidlo (co se vyskytuje na druhém konci sloupce) v čerstvé zkumavce.
- Chromatografické metody lze aplikovat pomocí sloupcových stolů nebo automatického HPLC zařízení. Separace pomocí HPLC může být provedena metodami reverzní fáze, výměny iontů nebo vyloučení velikosti a vzorky zjištěné pomocí diodového pole nebo laserové technologie.
Vizualizace bílkovin a hodnocení čištění
- Chromatografie na reverzní fázi (RPC) odděluje proteiny na základě jejich relativní hydrofobicity . Tato technika je vysoce selektivní, ale vyžaduje použití organických rozpouštědel. Některé proteiny jsou permanentně denaturovány rozpouštědly a během RPC ztratí funkcionalitu. Proto se tato metoda nedoporučuje pro všechny aplikace, zvláště pokud je nezbytné, aby cílový protein udržel aktivitu.
- Ion-výměnná chromatografie se týká oddělení proteinů na bázi náboje . Sloupky mohou být připraveny buď pro výměnu aniontů nebo výměnu kationtů. Aniontové výměnné sloupce obsahují stacionární fázi s kladným nábojem, který přitahuje negativně nabité proteiny. Kationtové výměnné sloupce jsou reverzní záporně nabité kuličky, které přitahují pozitivně nabité proteiny. Eluce cílového proteinu (proteinů) se provádí změnou pH v koloně, což vede ke změně nebo neutralizaci nabitých funkčních skupin každého proteinu.
- Chromatografie s vyloučením velikosti ( gelová filtrace ) odděluje větší proteiny od malých, protože větší molekuly cestují rychleji přes zesítěný polymer v chromatografické koloně. Velké proteiny se nezapadají do pórů polymeru, zatímco menší proteiny se dělají a trvají déle, než se pohybují chromatografickým sloupcem, a to prostřednictvím své méně přímé cesty. Eluát se shromažďuje v sérii trubek, které oddělují proteiny na základě eluční doby. Gelová filtrace je užitečným nástrojem pro koncentraci bílkovinného vzorku, protože cílový protein se shromažďuje v menším elučním objemu než byl původně přidán do kolony. Podobné metody filtrace mohou být použity při výrobě velkých proteinů kvůli jejich nákladové efektivitě.
- Afinitní chromatografie je velmi užitečnou technikou pro "leštění" nebo dokončení procesu čištění proteinů. Perličky v chromatografické koloně jsou zesíťovány na ligandy, které se specificky váží na cílový protein. Protein se potom odstraní z kolony promytím roztokem obsahujícím volné ligandy. Tato metoda poskytuje nejčistší výsledky a nejvyšší specifickou aktivitu ve srovnání s jinými technikami.
- SDS-PAGE je elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, která se provádí v přítomnosti SDS (dodecylsulfát sodný), který se váže na proteiny a poskytuje tak velký negativní náboj. Vzhledem k tomu, že obvinění všech bílkovin je poměrně stejná, tato metoda je odděluje téměř výhradně na základě velikosti. SDS-PAGE se často používá k testování čistoty proteinu po každém kroku v sérii. Vzhledem k postupnému odstranění nežádoucích proteinů ze směsi se sníží počet pásem vizualizovaných na gelu SDS-PAGE, dokud neexistuje pouze jeden pás představující požadovaný protein.
- Imunoblotting je technika vizualizace proteinu použitá v kombinaci s afinitní chromatografií. Jako ligandy na sloupci afinitní chromatografie se používají protilátky pro specifický protein. Cílový protein se ponechá na koloně, pak se odstraní propláchnutím sloupce solným roztokem nebo jinými činidly. Protilátky spojené s radioaktivními nebo barvivovými značkami pomáhají detekovat cílový protein, jakmile se oddělí od zbytku směsi.
Zdroje:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2. vydání. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.